前列腺癌的确诊还要依赖前列腺的穿刺活检，对于任何怀疑前列腺癌的患者，及时进行系统的前列腺穿刺活检，是早期确诊前列腺癌的重要一步，有些人甚至经过多次穿刺活检方可确诊。
现在通常采用12针的系统穿刺法，在超声引导下的穿刺可以提高穿刺的准确度。但是值得一提的是，即便是穿刺结果阴性的患者，也不能完全解除警报而放松警惕，一定要及时复查，必要时还要重复穿刺，以防漏诊。对于一些比较特殊的穿刺结果比如PIN/ASAP等，更要提高警惕，及时重复穿刺。
很多人拒绝穿刺的原因是担心一旦真的是癌，穿刺会导致癌细胞转移，刺激癌的生长。这是没有科学依据的，大宗数据的临床研究已经排除了这种可能。