大血管并发症是糖尿病的重要并发症，血管内皮功能紊乱是动脉硬化的早期病理生理阶段，在大血管并发症的发生、发展中起着关键作用，氧化应激是动脉硬化发生的机制之一。
内皮祖细胞(EPCs) 是一类定居于骨髓，可特异性归巢于血管内皮受损区域，并能分化增殖为成熟内皮细胞的一群干/祖细胞，在血管损伤或组织缺血的情况下 , 存在于骨髓中的EPCs可以应答于局部释放的生长因子和细胞因子，动员至外周血液循环，特异性的归巢于损伤或缺血部位，进一步增殖、分化为成熟的内皮细胞，参与血管新生和再内皮化。
Fadini GP等对糖调节受损和T2DM人群的EPCs进行研究表明，在糖调节受损人群，也就是糖尿病的前期，已经存在EPCs数量的减少，表明EPCs的下降伴随于糖尿病的自然病程，他认为糖尿病前期心血管危险因素的增加不仅与高血糖及伴发的其他代谢异常导致的内皮损伤有关，而且与循环祖细胞耗竭引起的内皮再生障碍有关，循环祖细胞的下降导致了心血管危险因素的聚集。氧化应激是引起EPCs下降的影响因素之一。
2型糖尿病具有家族聚集性，其子女是糖尿病的高危发病人群，我们的前期研究表明，在糖耐量正常的2型糖尿病患者子女已经出现血管内皮功能障碍。那么在这部分人群是否存在 EPCs数量的改变、氧化应激是否存在，他们之间的关系又是如何呢?目前这方面的研究较少。
本研究通过检测2型糖尿病(T2DM)患者及其一级亲属(FDRs)的内皮依赖性血管舒张功能(FMD)、循环EPCs数量、血清氧化物、抗氧化物的变化, 并探讨它们之间的关系，以期为预防和治疗T2DM及其大血管并发症的发生、发展提供依据。
资料与方法
一、研究对象
选择2008-2009年我院门诊及住院糖耐量试验(OGTT)确诊的2型糖尿病患者作为糖尿病组共40例，男22例，女18例，年龄(44.78±1.82)岁，所有受试者均符合1999年WHO 2型糖尿病诊断标准，均不伴有糖尿病视网膜病变、神经病变及肾脏病变。
选择2型糖尿病患者的子女作为FDRs组，共38例，男20例，女18例，年龄(46.87±1.91)岁，均排除空腹血糖受损、糖耐量受损和糖尿病;正常对照(NC)组 30例，男17例，女13例，年龄(44.07±1.89)岁，无糖尿病家族史。所有受试者经心电图、超声、血、尿、便检查均于正常范围，均排除高血压、冠心病、脑血管病及周围血管疾病，无肝、肾功能障碍，排除服用影响机体代谢的药物，排除应用胰岛素治疗者。
二、方法
1、血生化指标测定：血糖的测定采用葡萄糖氧化酶法，HBAlc测定采用化学法;血脂(胆固醇、甘油三酯)测定应用酶法测定，采用美国BeckmanL20型全自动生化仪;超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽-过氧化物酶(GSH-PX)、总抗氧化能力(TAO-C)应用比色法测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。胰岛素的测定应用化学发光法。
2、胰岛素敏感性及胰岛B细胞功能相关指标计算公式：
稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=(FPG×FIns)/22.5。
3、外周血EPC计数: 取外周血2mL，每个流式检测管分别加入150ul全血，加入10ul一抗;在同型对照管中加入10ul 缓冲液。并轻轻混匀。 避光孵育30分钟后每管分别加入2ml红细胞裂解液，混合均匀，室温避光孵育10分钟，3000r/min，离心5分钟，弃去上清。用2ml 缓冲液洗涤细胞一次，500ul 缓冲液重悬细胞后上流式仪检测。
确定CD34+KDR+细胞作为EPCs(试剂盒购自美国Invitrogen公司及R&D公司)。用FACS Calibur分析仪(美国BD公司)分析计数1×105细胞;数据再用软件(Macintosh CELLQuest; BD Biosciences)进行处理。
4、内皮依赖性血管内皮功能(FMD)的测定：采用二维超声成像扫描法测定(PHILIPS HDI 5000，美国通用公司)：患者平卧位，将血压计袖带缚于右侧前臂，袖带充气至高于收缩压50mmHg处，5min后放气引起反应性充血，30~90s内采集肱动脉图像并结合心电图测得舒张末期内径(Dd1)。反应性充血后肱动脉内径变化(FMD％)=(Dd1-Dd)/Dd×100％。
三、统计学处理
采用SPSS 13.0统计分析软件包进行分析。所有计量资料用均数±标准差表示，对所测定结果进行正态性及方差齐性检验，计量资料多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P<0.05为具有显著性差异。变量相关关系采用直线相关分析和多元直线回归分析。
结 果
1、三组临床和生化特征
从表1可以看出，三组在年龄、性别均匹配。BMI三组间无显著差异。收缩压、舒张压在三组间无显著性差异(P0.05)。FPG和HbA1c在T2DM组较对照组、FDRs组显著升高(P<0.05)，但在对照组与FDRs组间差异无显著性(P>0.05)。T2DM的TC水平高于FDRs及NC组(P<0.05)，TG在三组无显著差异;HOMA-IR在对照组、FDRs、T2DM组逐渐升高，有显著差异(P<0.05)。
2、三组氧化应激指标及脂肪因子的比较
从表2看出，血清SOD 、TAO-C及GSH-PX水平在T2DM组显著低于和对照组及FDRs(P<0.01)，但在FDRs和对照组间无统计学差异(P>0.05);血清MDA水平在对照组、FDRs及T2DM组逐渐升高(P<0.01)。
3、三组内皮功能各相关参数的比较
从表3看出，EPCs、FMD在对照组、FDRs、T2DM组逐渐减少，差异有统计学意义(P<0.05)。
讨 论
1997年，Asahara等研究发现，在循环外周血中存在一种能分化为血管内皮细胞(EC)的前体细胞，命名EPCs，它来源于骨髓、脐血或胎肝，表达某些特定的标志，如造血祖细胞标志：CD34 、 CD133和血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)[也被称作激酶功能区受体(KDR)或胎肝激酶-1(FLK-1)]和 CD31等内皮标志。
能在体外分离并培养出EPCs，并确定它的特性及功能。但因其费用较高而不能大规模用于临床研究。因此，用流式细胞术分析表面抗原来鉴定祖细胞被认为是金标准。目前很多研究认为可以将CD34+KDR+细胞作为EPCs,CD34 是造血干细胞的重要标志，而KDR 作为血管系统最早出现的细胞标志，是胚胎期血液血管发生的关键受体，也被作为血管 EPCs 的重要分子标志。
有些学者认为可以应用CD34+KDR+的 EPCs计数来独立地预测心血管事件的发生在正常情况下，EPCs数量相对较少，但在血管损伤或组织缺血的情况下 , 存在于骨髓中的EPCs可以应答于局部释放的生长因子和细胞因子而动员至外周血液循环，特异性的归巢于损伤或缺血部位，进一步增殖、分化为成熟的内皮细胞，参与血管新生和再内皮化。
一旦内皮祖细胞受损，内皮损害和修复之间的平衡被打破，内皮层的完整性遭到破坏，由此发生动脉粥样病变。因此EPCs对于调节内皮细胞凋亡/再生平衡及保持内皮层的完整性有着重要作用。EPCs尚能分泌生长因子激活血管局部的成熟内皮细胞，维持血管内皮的正常功能。
由此，我们可以认为EPCs数量与功能的改变与血管内皮功能密切相关，是血管疾病的重要影响因素，也就是说，骨髓和外周血的EPCs的数量与功能决定着损伤血管的内皮修复程度，所以，EPCs被认为是对各种心血管疾病和损伤血管进行治疗的重要生化因子。
糖尿病是心血管疾病的等危症，2型糖尿病与心血管疾病的高发生率和死亡率有关。本研究表明，FDRs及T2DM的EPCs数量较对照组显著减少，FMD显著下降，说明在糖耐量正常的糖尿病患者一级亲属已经存在EPCs数量的减少及血管内皮功能受损。
氧化应激(OS)是在缺血、缺氧、高血糖等应激情况下指机体活性氧基团(ROS)以及活性氮基团(RNS)等的过度生成和/或机体抗氧化能力降低导致活性分子清除减少，从而造成氧化系统与抗氧化系统的不平衡，导致组织中的氧自由基水平升高，引起组织损伤或潜在性损伤的病理过程。
抗氧化酶类包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、GSH-PX等，TAO-C 代表了细胞酶促与非酶促抗氧化物的总体水平。氧化应激是引起糖尿病血管并发症的机制之一，目前认为GPx-1及MnSOD活性下降是冠状动脉疾病患者心血管事件的独立危险因子。
本研究结果显示，T2DM组的血清SOD 、TAO-C及GSH-PX水平显著低于NC及FDRs组,血清MDA水平在FDRs及T2DM显著升高，说明在糖耐量正常的T2DM一级亲属已经存在氧化和抗氧化系统失衡,这与过去报道一致[8]。
Pearson相关分析表明，在FDRs，IR与MDA呈正相关，与SOD、TAO-C、GSH负相关,说明在糖尿病一级亲属氧化应激与IR密切相关。有研究表明，T2DM患者血糖正常非肥胖一级亲属存在胰岛素抵抗及肌细胞内脂类增多，出现骨骼肌线粒体功能障碍而导致的氧化应激[9]，而IR是机体细胞水平对过多ROS的一种生理性防御机制。
与其他组织细胞相比，β细胞内清除自由基的酶类(抗氧化酶)以及ROS清除蛋白如硫氧还蛋白的含量很低，因而对活ROS极为敏感，最易受氧化应激攻击，因此，在内源性抗氧化系统代偿不足时，机体就会出现氧化还原失衡，激活应激敏感性信号通路，引起β细胞功能失调，进一步加重IR，最终导致T2DM及其慢性并发症的发生。
由此我们可以推测，由于遗传和环境因素的影响，出现氧化应激，二者相互促进，进一步导致胰岛素抵抗及β细胞功能衰竭，从而诱发了糖尿病及其并发症的发生、发展。
把EPCs作为因变量进行多元线性回归分析表明，TOA、MDA、GSH-PX、FBG、HbA1c进入方程(R=0.979，P<0.05)，差异有统计学意义，说明血糖水平及氧化应激是EPCs的影响因素。
高血糖及其代谢产物可以通过多种途径影响EPCs及血管内皮功能，从而导致血管并发症的发生：
(1)高糖和TNF-α通过激活EPCs内的p38-MAPK从而下调EPCs的数量;
(2)高糖介导的FoxO转录因子磷酸化/乙酰化失衡,可能使FoxO蛋白表达增加,上调前凋亡基因表达,介导EPCs凋亡，Sir2 (silent information regulator-2,沉默信息调节因子-2 ) 对FoxO具有反向调节作用，高糖通过Sir2而影响FoxO，进一步导致EPC功能受损。
(3)高糖导致EPCs释放的NO的生物利用度降低或eNOS的辅基四氢生物蝶呤(BH4)下降，从而出现eNOS的解偶联，产生超氧负离子(O-)，导致活性氧簇(ROS)的积聚，进一步使EPCs的数量及迁移能力降低。
(4)高血糖通过使EPCs功能受损而释放微粒(MPs)，而MPs通过启动外源性凝血途径以及与血小板形成聚合物可促进血栓和纤维蛋白的形成;激活中性粒细胞,促进单核细胞与内皮细胞结合并对中性粒细胞产生趋化作用,参与炎症反应的发生，从而影响血管内皮功能。
氧化应激通过促进EPCs的调亡而影响其功能及数量，其分子机制为： forkhead转录因子调控的促凋亡蛋白Bim的表达是EPCs凋亡的一个关键信号通路，氧化应激可通过诱导B im 的表达水平上调, 引起EPCs凋亡 ，HMG2CoA还原酶抑制剂statins可通过PI3 /Akt信号通路磷酸化forkhead转录因子,使其失活, 从而下调Bim表达水平, 保护EPCs不发生氧化应激引起的细胞凋亡;
氧化应激还可通过ROS-p53-Bax途径引起EPCs的凋亡[14]，诱导EPCs端粒酶的失活而促进其衰老及调亡。曾有报道显示，Eric的研究也表明，应用锰超氧化物岐化酶(MnSOD)转染的EPCs可促进糖尿病小鼠的伤肢愈合。
总之，本研究表明，在糖耐量正常的2型糖尿病一级亲属已经出现了胰岛素抵抗、氧化应激、内皮祖细胞数量的减少及血管内皮功能受损，而氧化应激可能是糖尿病及其血管并发症的始发因素。